Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Bazı organlar çözünür faktörler üretir ve meme kanseri metastazı için tercihli bölgeler haline gelir. Bu hasat edilen organ hücrelerinden hazırlanan şartlandırılmış bir ortam, bu faktörlerin tanımlanmasına ve incelenmesine yardımcı olabilir.
Soğuk PBS içeren bir tüpe karaciğer gibi hasat edilmiş bir organ yerleştirerek ve organın artık kanını çıkarmak için tüpü yukarı ve aşağı çevirerek başlayın. Organı bir Petri kabına yerleştirin. Ve bir neşter kullanarak, organı küçük parçalara ayırın.
Bu parçaları, hücre büyümesini desteklemek ve kirlenmeyi önlemek için antibiyotikle desteklenmiş bazal bir ortam içeren bir tüpe yeniden kullanın. Şimdi, hücre süspansiyonu bir kültür plakasına dökün ve gerekli süre boyunca sürekli karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sırasında, bu hücreler metabolitleri, büyüme faktörlerini, hücre dışı matris proteinlerini ortama salır. Daha sonra, hücre süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve seyreltmek için taze ortam ekleyin. Tüpü santrifüjleyin ve şartlandırılmış ortam olan süpernatantı taze bir tüpe filtreleyin.
Aşağıdaki protokolde, meme kanseri hücrelerinin metastatik davranışlarını incelemek için fare akciğerlerinden ve beyinden şartlı medya hazırlayacağız.
Akciğer şartlandırılmış ortamı oluşturmak için, organlardan kalan kanı çıkarmak için akciğer dokusunun tüplerini üç kez ters çevirin. Daha sonra yıkamayı taze soğuk PBS ile değiştirin ve tuzlu su kansız olana kadar tekrarlayın.
Daha sonra, akciğerleri fare başına bir adet 60 milimetre kare cam Petri kabına aktarın ve dokuları tekrarlanan ileri geri dilimleme ile kıymak için iki steril neşter bıçağı kullanın.
Doku parçaları yaklaşık 1 milimetre küp büyüklüğünde olduğunda, parçaları antibiyotiklerle desteklenmiş uygun DMEM/F-12 ortamında yeniden depolayın ve dokuları 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de fare başına 6 kuyu plakasının bir kuyusunda kuluçkaya yatırın.
24 saat sonra, her kuyunun tüm içeriğini ayrı ayrı 50 mililitre konik tüplere aktarın ve şartlandırılmış ortamı tüp başına üç eşdeğer hacimde taze DMEM / F-12 ortamı ile seyreltin.
Büyük doku kalıntılarını çıkarmak için tüpleri santrifüjleyin. Daha sonra şartlandırılmış ortamı 0,22 mikron şırınga süzgeçten geçirerek tek bir 50 mililitrelik konik tüpe bir araya alın.
