Disección del Midgut de una mosca adulta: un método para aislar el tracto digestivo

Overview

En este video, destacamos una disección del intestino adulto de Drosophila y la colección de midguts adecuados para la disociación unicelular y FACS con el fin de aislar las células madre intestinales.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts por FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014).

NOTA: Si este protocolo se utiliza por primera vez para aislar los ISC por ordenación FAC, los siguientes controles son obligatorios para establecer inicialmente los parámetros FACS correctamente: Células disociadas del tipo salvaje (por ejemplo, w¹¹¹⁸⁾ Midguts de Drosophila sin Sytox. Células disociadas del tipo salvaje (por ejemplo, w¹¹¹⁸⁾ Drosophila midguts con sitix (ver Paso 3.6). Células disociadas de midguts de la línea de vuelo esg-Gal4, UAS-GFP sin Sytox.

1. Preparación de soluciones y platos para la disección intestinal

1. Prepare 4-6 viales cada uno que contengan 40 moscas hembra de la línea de moscas esg-Gal4, UAS-GFP.
2. A partir de una solución de stock PBS de 10x preparar 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, ajuste el pH a 7,4).
3. Preparar una solución de agarose del 3,5% en 1x PBS (3,5 g de agarose de grado electroforesis en 100 ml 1x PBS). Prepare placas de disección vertiendo esta solución en placas de Petri (diámetro 8,5 cm) para cubrir la parte inferior. La capa de agarose evita dañar las puntas de los fórceps durante el procedimiento de disección. Después de que el gel se ha solidificado almacenar las placas de disección a 4 °C.
4. Preparar 300 ml de 1x PBS + 1% BSA fresco antes de diseccionar y colocar la botella sobre hielo o a 4 °C.
5. Encienda la centrífuga y déjela enfriar a 4 °C.
6. Llama las puntas de 2 pipetas Pasteur de vidrio para suavizar los bordes.
7. Limpie dos pares de fórceps y una cuchilla de afeitar con un 70% de etanol.
8. Coloque de cuatro a seis tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para recoger midguts diseccionados sobre hielo.

2. Preparación del Tracto Gastrointestinal y Disección del Midgut

1. El anestesiado vuela de un vial (40 moscas) con CO₂ en un lecho de mosca estándar, decapita a todas las moscas usando una cuchilla de afeitar y transfiéralas al plato de disección. Vierta la solución fría 1x PBS/1% BSA en el plato de disección para cubrir el gel de agarose. Las moscas flotarán.
2. Coge el abdomen de la mosca con un par de fórceps, mientras sostienes el tórax con el otro par de fórceps. Separe el tórax del abdomen. El intestino será visible y lo más probable es que el foregut/cultivo todavía esté conectado al tórax.
3. Coge la tripa y sácarla del tórax. Para desplegar el intestino, agarre el cultivo y tire del intestino ligeramente antes lejos del abdomen.
4. Coge el extremo posterior del abdomen con un par de fórceps y el borde de la cutícula anteriormente abierta con el otro par de fórceps. Tenga cuidado de no destruir el tejido intestinal saliente. Tire del extremo posterior para romper la cutícula y continúe tirando posteriormente muy suavemente hasta que todo el intestino haya sido sacado de la cavidad abdominal. El cultivo puede tener que ser retirado de antemano si es demasiado grande para caber a través de la cavidad del cuerpo.
5. Retire el foregut, los túbulos malpighianos, el hindgut y los ovarios dejando el midgut desnudo.
6. Usando una pipeta Pasteur de vidrio, transfiera el lote de midguts diseccionados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga solución fría 1x PBS/1% BSA y mantenga el tubo en hielo. Las muestras deben procesarse en un plazo de 2 horas.
7. Una vez completada la disección de todo un lote, enjuague el plato de disección con agua destilada doble para lavar los restos sobrados. Comience a diseccionar el siguiente lote de midguts (repita los pasos 2.1–2.7). Disecciona tantos lotes como sea posible en 2 horas y, a continuación, continúa con el paso 3.1.

3. Digestión del tejido intestinal para cosechar células para la clasificación de FAC

1. Retire la solución BSA 1x PBS/1% de los midguts y agregue 500 μl de solución Trypsin-EDTA al 0,5% a cada muestra.
2. Vórtice bien durante 20 s e incubar las muestras balanceándose/girando suavemente a 20 rpm a temperatura ambiente durante 25-30 min.
3. Vórtice de nuevo después de unos 30 minutos y dejar que el tejido midgut intacto se hunda en la parte inferior del tubo. Retire cuidadosamente las células que están en suspensión con una pipeta pasteur de vidrio flameado y filtrelas a través de una malla de nylon de 35 μm en un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.
4. Gire las celdas hacia abajo a 100 x g durante 5 minutos a 4 °C. Cabe destacar que al iniciar el resumen, es posible que un pellet de celda no sea visible al principio, pero se hará visible a medida que avance el resumen del tejido.
   1. Transfiera cuidadosamente la solución Trypsin al tubo de muestra original que contiene el tejido midgut intacto restante. Evite transferir demasiadas células del pellet.
   2. Vuelva a suspender suavemente el pellet celular en 400 μl de PBS/1% BSA frío. Mantenga los tubos de microcentrífuga que contienen las células disociadas sobre hielo y cubra los tubos con papel de aluminio para proteger las células de la luz.
   3. Vórtice la solución Trypsin que contiene el tejido midgut intacto restante de nuevo y colocar las muestras en el balancín durante otros 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Repita los pasos del 3,3 al 3,4,3 hasta que se haya digerido todo el tejido midgut. Combine las células disociadas de todos los tubos de microcentrífuga en un tubo de microcentrífuga. Esto puede requerir un paso de centrifugación como en 3.4, ya que el volumen de todas las suspensiones celulares combinadas puede superar los 1,5 ml. Mantenga la suspensión celular en el hielo y proteja las células de la luz.
6. Gire las celdas disociadas hacia abajo a 100 x g durante 5 minutos a 4 °C. Retire cuidadosamente la mayor cantidad posible del sobrenadante dejando aproximadamente 50-100 μl de la solución 1x PBS/1% BSA en el tubo de microcentrífuga. Resuspend suavemente las células disociadas en 800 μl 1x PBS/1% BSA que contiene Sytox (1:20,000).
7. Transfiera la suspensión celular a un tubo Falcon de fondo redondo de 5 ml filtrando las células a través de una tapa de presión del colador celular (malla de nylon de 35 μm). Mantenga siempre muestras celulares en hielo y protegidas de la luz. Las celdas ya están listas para ser ordenadas.
8. Pipeta 600 μl de solución RNAlater en cada tubo de microcentrífuga en el que se ordenarán las células para su posterior aislamiento de ARN. Para otras aplicaciones posteriores, las células se pueden recoger en una solución diferente, por ejemplo, en PBS estéril.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting