Congelamento-cracking dei nematodi: un metodo per esporre i tessuti dei vermi interni per la colorazione

- Trasferimento lavato C. Elegans in liquido su uno scivolo di vetro precedentemente rivestito con polilisina, un composto che aiuterà le cuticole del verme a attaccarsi alla superficie del vetro. Premere delicatamente un altro scivolo di vetro direttamente verso il basso con un bordo sporgente sullo scivolo inferiore. Per immobilizzare i vermi senza danni, comprimere gli animali evitando movimenti collaterali. Quindi, posizionare gli scivoli di vetro con vermi sandwich su un blocco metallico all'interno di un contenitore di laboratorio isolato riempito con un agente congelante, come azoto liquido o ghiaccio secco.

Il metallo è un conduttore di temperatura efficace che garantisce che la superficie del blocco sia abbastanza fredda da congelare rapidamente le cuticole del verme su entrambe le superfici di vetro. Una volta congelati, separare rapidamente le diapositive di vetro per smontare o rompere le cuticole del verme. Procedere con la fissazione e la colorazione dei tessuti poiché l'interruzione della cuticola a bassa permeabilità consente ai fissatori chimici e agli anticorpi di colorazione di accedere ai tessuti dei vermi interni. Nel seguente protocollo, vedremo una dimostrazione dettagliata della tecnica di congelamento-cracking e della fissazione dei tessuti.

- In primo luogo, preparare una diapositiva per fissare i vermi. Pipetta 30 microlitri di poli-L-lisina su uno scivolo, una nd quindi, impostare una seconda diapositiva sull'altra e strofinarli insieme per stendere la soluzione uniformemente su entrambi. Ora, sbucciare i due scivoli e lasciarli asciugare all'aria per 30 minuti.  

Quindi, posizionare un blocco metallico piatto in un contenitore pieno di azoto liquido. Lavare le piastre con soluzione M9 e trasferire circa 10 microlitri di M9 contenenti i vermi. In alternativa, raccogliere i vermi e aggiungere M9 allo scivolo.

Una volta trasferiti i vermi, far cadere delicatamente un coverslip su di essi in modo che il coverslip si sovrasta di un bordo. Quindi, premere delicatamente il coverslip senza effettuare movimenti laterali.

A questo punto, trasferire immediatamente la diapositiva nel blocco metallico in azoto liquido e lasciarla congelare. Dopo cinque minuti, scorrere fuori dal coperchio utilizzando il bordo strapiombante. Eseguire rapidamente questa procedura per ottenere la corretta fessura della cuticola.

Successivamente, immergere lo scivolo in un barattolo di coplin di vetro riempito con metanoloa meno 20 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, trasferire lo scivolo in un barattolo di coplin di vetro riempito di acetone per altri cinque minuti alla stessa temperatura. Le diapositive possono essere macchiate direttamente o conservate a meno 20 gradi Celsius.