Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Overfør vasket C. ebelgfrukter i væske på et glasssklie som tidligere var belagt med polylyin, en forbindelse som vil hjelpe orm cuticles holde seg til glassoverflaten. Trykk forsiktig et annet glass gli rett ned med en kant som ligger over bunnsklie. For å immobilisere ormene uten skade, komprimer dyrene unngå sidebevegelser. Plasser deretter glasssklier med sandwiched ormer på en metallblokk inne i en isolert laboratoriebeholder fylt med et frysemiddel, for eksempel flytende nitrogen eller tørris.
Metall er en effektiv temperaturleder som sikrer at blokkoverflaten er kald nok til raskt å fryse ormens neglebånd til begge glassflatene. Når det er frosset, kan du raskt skille glasssklier for å trekke fra hverandre eller sprekke opp ormekariklene. Fortsett med vevsfiksering og farging som forstyrrelse av den lave permeabilitetskarakleren gjør det mulig for kjemiske fikserings- og fargingsantistoffer å få tilgang til det indre ormevevet. I følgende protokoll vil vi se en detaljert demonstrasjon av fryse-sprekkteknikken og vevsfiksering.
- Forbered først et lysbilde for å fikse ormene. Pipette 30 mikroliter poly-L-lysin på en sklie, ennd da, sett et nytt lysbilde på den andre og gnidem sammen for å spre løsningen jevnt på begge. Nå, skrell fra hverandre de to lysbildene og la dem lufttørke i 30 minutter.
Deretter legger du en flat metallblokk i en beholder fylt med flytende nitrogen. Vask platene med M9-løsning og overfør ca 10 mikroliter M9 som inneholder ormene. Alternativt, velg ormene og legg M9 til lysbildet.
Når ormene er overført, slipp forsiktig en deksler på tvers av dem slik at dekslene overhenger over en kant. Trykk deretter forsiktig på dekslene uten å gjøre sidebevegelser.
Overfør nå gliden umiddelbart til metallblokken i flytende nitrogen og la den fryse. Etter fem minutter, flikk av dekslene ved hjelp av den overliggende kanten. Gjør dette raskt for å få riktig sprekk på neglebåndet.
Deretter senker du skredet i en metanolfylt Coplin-krukke ved minus 20 grader Celsius. Etter fem minutter, overfør gliden til en acetonfylt Glass Coplin krukke i ytterligere fem minutter ved samme temperatur. Lysbildene kan farges direkte eller lagres ved minus 20 grader Celsius.
