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15.14: PCR
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PCR
 
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15.14: PCR

개요

폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR은 DNA의 세그먼트를 복사하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 기하급수적 증폭으로 인해 PCR은 단 몇 시간 내에 수백만 또는 수십억 개의 DNA 사본을 생산할 수 있습니다. PCR 반응에서 내열성 DNA 폴리머라제 효소는 열순환기라고 하는 자동화 된 기계 내부의 일련의 온도 변화를 통해 원래 DNA를 증폭시킵니다.

PCR은 분자 생물학에 혁명을 일으켰습니다.

카리 멀리스는 1983년에 PCR을 개발하여 1993년 노벨 화학상을 수상했습니다. 상대적으로 빠르고 저렴하며 정확한 DNA 서열을 복사하는 PCR은 분자 복제, 유전자 돌연변이 발생, 병원체 검출, 유전자 발현 분석, DNA 양 및 시퀀싱 및 유전 질환 진단을 포함한 수많은 응용 분야에 귀중한 도구가 되었습니다.

PCR 반응 주기

PCR은 세포에서 발생하는 자연적인 DNA 복제 프로세스를 모방합니다. 반응 혼합물은 복사할 템플릿 DNA 서열, 프라이머에게 불린 짧은 DNA 분자의 쌍, 탈옥뉴클레오티드 삼위산염에게 불린 자유로운 DNA 빌딩 블록 (dNTPs), 및 전문 DNA 폴리머라제 효소를 포함합니다.

PCR은 고온에서 일련의 단계를 포함, 이러한 온도에서 기능 DNA 폴리머 라제 효소를 필요로. 가장 일반적으로 사용되는 DNA 폴리머라제는 Taq 폴리머라제이며, 더무스 수생술의이름을 따서 명명되었으며, 중합체가 처음에 분리된 박테리아이다. DNA 폴리머라제는 DNA 분자를 처음부터 합성할 수 없거나 드 노보를 합성할 수 없습니다. 대신, DNA 폴리머라제는 보완적인 염기 페어링을 통해 DNA 템플릿에 결합하는 프라이머에게 불린 짧은 DNA 분자에 추가합니다. 프라이머는 DNA 폴리머라제가 새로운 dNTP를 부착할 수 있는 무료 3' 하이드록실 그룹을 제공합니다. DATP, dCTP, dGTP 및 dTTP : PCR에 dNTPs의 네 가지 유형이 있습니다, DNA 분자에 있는 각 뉴클레오티드에 대해 하나.

각 PCR 주기는 세 단계로 구성됩니다: 데니션, 아닐링 및 DNA 합성.

  1. 변성. PCR 주기는 반응 혼합물을 고온으로 가열하여 DNA 이중 나선을 두 가닥으로 분리함으로써 시작됩니다. 이 "용융"공정은 일반적으로 90 ° C - 100 ° C의 온도에서 발생합니다.
  2. 어 닐 링. 반응 혼합물은 빠르게 냉각됩니다 (일반적으로 50 ° C-65 ° C), 두 프라이머는 템플릿 DNA 가닥에 자신의 보완 서열에 바인딩 할 수 있도록.
  3. DNA 합성 (프라이머 확장). 반응 혼합물은 다시 가열되며, 이번에는 DNA 폴리머라제가 템플릿 가닥의 베이스와 짝을 이루는 dNTP를 추가하여 프라이머를 확장 할 수있는 온도 (보통 60 ° C-75 ° C)로 가열됩니다.

일반적인 PCR에는 열순환기에서 발생하는 이 세 단계의 20-40반복 사이클이 포함됩니다. DNA 분자의 수는 각 주기에서 두 배가 되기 때문에 DNA는 기하급수적으로 증폭됩니다.

PCR의 제한 사항

과학자가 게놈의 특정 스트레칭을 증폭하고 싶은 경우에, 과학자는 적당한 프라이머를 디자인하기 위하여 표적 DNA 순서의 적어도 부분을 알고 있어야 합니다. 또 다른 잠재적인 문제는 부분적으로 유사한 DNA 서열에 프라이머의 비특이적 어닐링, 비 표적 DNA의 증폭으로 이어지는. 이 문제는 반응 조건을 최적화하여 제어할 수 있습니다. 매우 민감한 검출 방법이기 때문에 PCR은 오염에 취약하며 미량의 DNA조차도 오해의 소지가 있는 결과를 초래할 수 있습니다. PCR에 사용되는 DNA 중합체는 오류가 발생하기 쉽습니다. 돌연변이가 처음 몇몇 주기 안에 생기면, 증폭된 DNA의 대부분은 돌연변이를 전송할 것입니다.


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