15.14: PCR
概要
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAの断片をコピーするために広く使われている技術です。指数関数的な増幅により、PCRはわずか数時間で数百万から数十億のDNAコピーを作り出すことができます。PCR反応では、耐熱性のDNAポリメラーゼ酵素が、サーモサイクラーと呼ばれる自動機械の中で、一連の温度変化を通して元のDNAを増幅します。
PCRは分子生物学に革命をもたらした汎用性の高い手法
1983年にカリー・マリス(Kary Mullis)がPCRを開発し、1993年にノーベル化学賞を受賞しました。PCRは、比較的早く、安価で、正確にDNA配列をコピーできるため、分子クローニング、遺伝子変異誘発、病原体の検出、遺伝子発現解析、DNAの定量と配列決定、遺伝病の診断など、さまざまな用途で非常に重要なツールとなりました。
PCRの反応サイクル
PCRは、細胞内で起こる自然なDNA複製過程を模倣しています。反応混合物には、コピーされるべき鋳型DNA配列、プライマーと呼ばれる一対の短いDNA分子、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）と呼ばれる遊離のDNA構成要素、および特殊なDNAポリメラーゼ酵素が含まれます。
PCRは高温で一連の作業を行うため、そのような温度でも機能するDNAポリメラーゼ酵素が必要です。最も一般的なDNAポリメラーゼは、最初にポリメラーゼが分離された細菌であるThermus aquaticusにちなんで名付けられたTaqポリメラーゼです。DNAポリメラーゼは、DNA分子をゼロ（de novo）から合成することはできません。その代わりに、DNAポリメラーゼはプライマーと呼ばれる相補的な塩基対に結合する短いDNA分子を介してDNAテンプレートに結合します。プライマーは、DNAポリメラーゼが新しいdNTPを結合できる遊離の3’ヒドロキシ基を提供します。PCRでは、DNA分子の各ヌクレオチドに対応して、dATP、dCTP、dGTP、dTTPの4種類のdNTPが使用されます。
各PCRサイクルは、「変性」、「アニーリング」、「DNA合成」の3つのステップで構成されています。
- 変性。PCRサイクルは、反応混合物を高温に加熱し、DNAの二重らせんを2本に解離することで開始されます。この解離プロセスは、通常、90°C–100°C前後の温度で行われます。
- アニーリング。反応混合物を急速に冷却し（通常50°C–65°C）、2つのプライマーが鋳型DNA鎖上の相補的な配列に結合できるようにします。
- DNA合成（プライマー伸長）：反応混合物を再度加熱し、今度はDNAポリメラーゼが鋳型鎖の塩基と対になるdNTPを加えてプライマーを伸長できる温度（通常60°C–75°C）にします。
一般的なPCRでは、これら3つのステップをサーモサイクラーで20～40サイクル繰り返します。各サイクルでDNA分子の数が2倍になるため、指数関数的にDNAが増幅されていきます。
PCRの限界
もし科学者がゲノムの特定の配列を増幅したい場合、科学者は適切なプライマーを設計するために、ターゲットDNAの配列の少なくとも一部を知っていなければなりません。また、部分的に類似したDNA配列にプライマーが非特異的にアニーリングしてしまい、非標的DNAが増幅されてしまうという問題もあります。この問題は、反応条件を最適化することで抑制できます。高感度の検出法であるPCRは、汚染にも弱く、微量の汚染DNAが混入しただけで、誤解を招く結果となります。PCRに使用されるDNAポリメラーゼは、エラーを起こしやすいです。最初の数サイクルで突然変異が起こると、増幅されたDNAのほとんどがその変異を持つことになります。
