Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.13: Tamamlayıcı DNA

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
Tamamlayıcı DNA
 

15.13: Tamamlayıcı DNA

Genel bakış

Sadece haberci RNA'ya (mRNA) aktarılan genler aktiftir veya ifade edilir. Bilim adamları, bu nedenle, farklı hücre ve dokularda gen ekspresyonu çalışma için hücrelerden mRNA ayıklamak. Bilim adamı ters transkripsiyon yoluyla mRNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürür. mRNA intronlar (kodlamayan bölgeler) ve diğer düzenleyici dizileri içermediğinden, genomik DNA'nın aksine cDNA, araştırmacıların gen tarafından kodlanmış peptidin amino asit dizisini doğrudan belirlemelerine olanak tanır.

cDNA Sentezi

cDNA çeşitli yöntemlerle oluşturulabilir, ancak ortak bir yol önce hücrelerden toplam RNA ayıklamak ve daha sonra mRNA'yı daha baskın tiplerden izole etmektir— transfer RNA (tRNA) ve ribozomal (rRNA). Olgun ökaryotik mRNA bir poli (A) kuyruğu vardır-adenin nükleotid bir dize-onun 3 'sonuna eklendi, RNA diğer türleri yok iken. Bu nedenle, timin nükleotidler bir dize (oligo-dTs) bir sütun veya manyetik boncuk gibi bir substrat eklenebilir, özellikle baz-çift ile özellikle mRNA poli (A) kuyrukları. Poli(A) kuyruklu mRNA yakalanırken, diğer RNA türleri yıkanır.

Daha sonra, retrovirüslerden dna polimeraz enzimi olan ters transkriptaz, mRNA'dan cDNA üretmek için kullanılır. Çoğu DNA polimeraz gibi ters transkriptaz da bir zincirin 3' ucuna nükleotit ler ekleyebildiği için, cDNA sentezi için bir başlangıç noktası sağlamak için poli(A) kuyruğuna bağlanmak için bir poli(T) astarı eklenir. CDNA iplikçik bir saç tokası halka biter. RNA daha sonra alkali tedavisi veya RNase enzimleri ile genellikle bozulur ve tek iplikçikli cDNA bozulmaz.

CDNA'yı tamamlayan ikinci bir DNA iplikçik daha sonra DNA polimeraz tarafından sentezlenir— genellikle ilk cDNA iplikçiklerinin saç tokası halkası veya astar olarak mRNA'nın çentikli bir parçası kullanılarak.

Elde edilen çift iplikli cDNA bakteriyel veya viral vektörlere yerleştirilmesi ve standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak klonlanabilir. Ek araştırmalar için hücre veya dokudaki tüm mRNA'ları temsil eden bir cDNA kitaplığı da oluşturulabilir.


Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter